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文獻解讀 | 微生物單細胞項目案例-香港大學張彤教授團隊首次繪制活性污泥微生物及耐藥基因單細胞圖譜
網(wǎng)站編輯：墨卓生物 │ 發(fā)布時間：2024-10-23
近日，香港大學張彤教授團隊在Environmental Science and Ecotechnology（IF=14）在線發(fā)表題為“High-throughput single-cell sequencing of activated sludge microbiome”的論文。該研究首次利用微生物單細胞基因組測序技術繪制了活性污泥樣本中微生物和耐藥基因的單細胞圖譜，增強了我們對這一復雜樣本微生物組中水平基因轉移（HGT）的理解，特別是與耐藥基因（ARGs）相關的HGT，為活性污泥生態(tài)系統(tǒng)提供了新的見解。
文章中使用的微生物單細胞基因組檢測技術為墨卓生物的MobiMicrobe-seq，該技術曾于2022年發(fā)表于頂尖期刊Science雜志，是一款能夠基于液滴法實現(xiàn)復雜微生物樣本超高通量微生物單細胞基因組測序的技術平臺?；谧灾餮邪l(fā)的液滴微流控儀器和配套試劑，在液滴生成、融合等過程中實現(xiàn)復雜樣本中單個細菌細胞的包裹、裂解、全基因組擴增、片段化、加標簽等精微實驗，助力客戶深入細胞和菌株水平研究，溯源質(zhì)粒、噬菌體等可移動遺傳元件介導的水平基因轉移事件，解析微生物間密切的相互作用關系。
背景
活性污泥（AS）作為污水處理廠廣泛采用的生物處理方法，對保護環(huán)境和人類健康至關重要，其包含微生物種群豐富多樣，了解它們的種類和作用是優(yōu)化其處理效率的關鍵。污水處理廠是抗生素耐藥基因交換的關鍵場所，基于“One Health”概念的提出，需要強調(diào)在污水處理廠開展ARG研究的必要性。高通量測序和宏基因組分析的發(fā)展有助于了解微生物群落，但仍面臨細胞基因組異質(zhì)性、微生物暗物質(zhì)發(fā)現(xiàn)、無法準確地將ARGs和可移動遺傳元件（MGEs，如質(zhì)粒和噬菌體）與其特定的單個宿主細胞聯(lián)系起來等挑戰(zhàn)。單細胞測序能解決這些問題，提供單個細胞的遺傳信息，推動抗生素耐藥性發(fā)生、MGE-宿主關系等課題研究發(fā)展。多種技術促進了單細胞測序發(fā)展，如分選平臺和微流控平臺整合應用，但尚未有研究對活性污泥樣品進行高通量單細胞基因組測序分析。
研究結果
單細胞測序揭示了AS微生物群落的組成和多樣性
該研究獲得了350 GB的原始測序數(shù)據(jù)（1.1×109 reads），揭示了15,110個單細胞水平的single-amplified genomes (SAGs)和2,454個物種水平上的SAG bins，污染度比較低（平均0.8%）。研究發(fā)現(xiàn)了27.5%的物種水平SAG bins屬于的新基因組。分析SAG bins多樣性后發(fā)現(xiàn)1,918個（95.7%）細菌SAG bins和38個古菌SAG bins（0.4%）。細菌主要分布在變形菌門、擬桿菌門和藍細菌門，相對豐度分別為25.6%、25.5%和12.8%。其中包括一些AS常見功能菌群，例如 3類氨氧化細菌g_Nitrosomonas和1類亞硝酸氧化細菌o_Nitrospiria。研究者還從中發(fā)現(xiàn)了一些新的固氮微生物類群，如Omnitrophota候選細菌門，這種細菌尚未被分離出來，也知之甚少?？傮w而言，基于液滴微流控的單細胞測序確保了少數(shù)細菌群體的測序、組裝和注釋，能夠找到被宏基因組組裝基因組(MAGs)忽視的一些低豐度微生物，比如3.5%豐度的21個細菌門僅在單細胞數(shù)據(jù)中存在，體現(xiàn)了單細胞基因組測序技術在具有挖掘低豐度群體和發(fā)現(xiàn)新分類菌群上的巨大潛力。
圖1 微生物單細胞測序獲得的SAG bins及物種信息
圖2 SAGs bin的注釋結果及與宏基因組MAG方法的比較
單細胞測序揭示了活性污泥中ARGs、質(zhì)粒和噬菌體的分布，及其與宿主的關系
（1） ARGs及其宿主的分析
在15,110個SAGs中檢索到1,137個ARGs，相當于每個細胞約0.9個ARG 拷貝。之前的文獻顯示在WWTP的AS樣本中每個細胞有0.3-0.7個ARGs拷貝。單細胞測序結果與之前結果的一致性證實了單細胞測序的準確度。在本次單細胞測序結果中，排名前四的ARGs種類分別是四環(huán)素、MLS、β-內(nèi)酰胺和多藥耐藥類，它們主要在變形菌門(41.8%)、Patescibacteria菌門(14.2%)和厚壁菌門(11.0%)的細菌中檢出。平均而言，32.8%的ARGs出現(xiàn)在質(zhì)粒上?？紤]到質(zhì)粒的高傳播性，在質(zhì)粒中出現(xiàn)頻率較高的ARGs對環(huán)境和人類有較高風險。此外，相同的AS樣品也進行了宏基因組得到ARG譜圖。結果顯示宏基因組結果中的ARG拷貝數(shù)為每個細胞0.3個，與單細胞測序數(shù)據(jù)相比在耐藥基因類別和豐度上有一些差異?？偨Y而言，單細胞測序是揭示更多ARG-宿主菌關系的有力工具，而這些關系在宏基因組學極有可能無法被檢測到。
圖3 單細胞測序揭示ARGs的宿主關系
（2）質(zhì)粒及其宿主的分析
該研究中在1,514 SAG bin中注釋到10,450個質(zhì)粒片段，平均長度5.5 kb，593個能夠進行分類學注釋，并被劃分為41個菌門，其中數(shù)量最多的前三個門是變形菌門(193)、Patescibacteria菌門(82)和厚壁菌門_A (70)。進一步分析這些質(zhì)粒在細菌中的關聯(lián)關系，在有物種注釋信息的273 SAG bins中找到了12,819個對應關系，這些結果充分證明了質(zhì)粒作為環(huán)境中典型的MGEs和微生物中HGT的關鍵成分對抗菌素耐藥性傳播的關鍵作用，也體現(xiàn)了微生物單細胞基因組測序技術在還原質(zhì)粒與細菌細胞歸屬關系以及解析細菌間潛在質(zhì)粒轉移現(xiàn)象的強大優(yōu)勢。
圖4 單細胞測序揭示質(zhì)粒的宿主關系
（3）噬菌體及其宿主的分析
作者在617個SAG bins中獲得了總共1,343個噬菌體contigs，包括563個細菌SAG bins、5個古菌SAG bins和49個未分類SAG bins。有尾噬菌體綱在Shatin wastewater treatment plants (ST WWTPs)中具有優(yōu)勢地位，只有7.9%的噬菌體能夠在目水平上被注釋，這表明AS系統(tǒng)的噬菌體挖掘潛力巨大，并且迫切需要擴大現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫多樣性。
近年來，噬菌體引起的ARG傳播被認為是導致新的多重耐藥性菌株出現(xiàn)的重要機制。本研究中檢測到五種噬菌體攜帶的ARGs，包括MLS (2)、四環(huán)素(1)、多藥耐藥(1)和氨基糖苷類(1)。作為一種典型的MGE，噬菌體在原核生物進化中起著重要的作用，該研究識別了可以感染不同宿主的噬菌體，并且鑒定了184組宿主-噬菌體關系，其中59組在宿主的不同分類水平上顯示出保守性。一些噬菌體表現(xiàn)出廣譜的宿主范圍，例如，Patescibacteria菌門的噬菌體也可以侵染其他五個門的宿主，如變形菌門和擬桿菌門。微生物單細胞基因組測序技術精準還原單個細菌中包含的噬菌體信息，能夠深入了解噬菌體對細菌的影響，尤其是具有多個宿主的噬菌體，對于WWTPs等環(huán)境中微生物群落的調(diào)控具有重要意義。
圖5 單細胞測序揭示噬菌體的宿主關系
結合單細胞測序和宏基因組學揭示AS微生物組的復雜性
結合單細胞測序和宏基因組學的聯(lián)合分析方法可以獲得更好的基因組得率和更準確的微生物種群分辨率。2,454個SAG bins中有812個基因組的質(zhì)量通過MAGs的整合輔助得到改善。一方面，基因組的平均完整度有所提高，使得中高質(zhì)量的基因組數(shù)目增多；但另一方面，污染度增加導致一些完整度較高的基因組被判定為中質(zhì)量基因組。因此，如何利用算法來提高基因組的完整性，并確保低污染水平，將是后續(xù)分析方法開發(fā)的關鍵技術問題。另有98個之前“未分類”的SAG bins成功被注釋到20個細菌門。此外，聯(lián)合分析增加了SAG bins中ARGs、質(zhì)粒和噬菌體的宿主關系信息的獲?。侯~外注釋到了22個ARGs, 60個質(zhì)粒片段和51個噬菌體片段。以上結果表明，MAG和SAG在完善基因組信息方面具有互補作用。SAG可以確定正確的組裝結果，并提供更多MAG不同細胞間異質(zhì)性的細節(jié)。這兩種測序方法的結合可以從宏觀和微觀兩個角度全面揭示微生物群落。作者也強調(diào)需要開發(fā)更加全面和適合的算法來整合兩種組學的數(shù)據(jù)。
圖6 單細胞測序和宏基因組學的互補結果
通過上述研究成果，我們可以看到了微生物單細胞基因組測序技術在基因組異質(zhì)性挖掘、少數(shù)群體驗證、宿主-MGE（可移動遺傳元件）關系鑒定等方面具有顯著優(yōu)勢。特別是針對抗生素抗性基因轉移的探索，不僅更好地實現(xiàn)對污水處理過程中的耐藥基因監(jiān)測，也揭示了MobiMicrobe微生物單細胞基因組技術在環(huán)境領域的應用潛力。這對于在“同一個健康”方法下保護公共衛(wèi)生至關重要。除了對改進監(jiān)測和選擇策略鋪平道路外，本研究也證實了，單細胞測序和宏基因組的聯(lián)合分析有助于提升微生物群落信息的完整性和準確性。相信隨著該技術平臺在樣本預處理、生信算法開發(fā)等方面的逐漸優(yōu)化完善，能夠更好地繪制不同微生物組的圖譜、探究不同條件下微生物種群的動態(tài)變化及其對干擾的響應，助力微生物組學研究的全新未來！
產(chǎn)品推薦
基于MobiMicrobe-seq技術的微生物單細胞基因組產(chǎn)品
墨卓生物MobiMicrobe-seq技術發(fā)表在《Science》雜志，搭載于MobiNova?-M1儀器和配套試劑盒，集成了多種液滴微流控操作技術和定制開發(fā)的生物信息學分析方法，不需要培養(yǎng)即可從復雜微生物群落中獲取成千上萬個單細胞微生物的基因組信息，并組裝出高質(zhì)量的菌株水平基因組，從而能夠在不損失分辨率或廣泛物種適用性的基礎上探究微生物群落的基因組。該方法應用面廣泛，可用于具有復雜微生物群落的樣本，如糞便、土壤和海洋等，在微生態(tài)研究中具有極大的市場應用潛力。
墨卓生物是一家以微流控芯片技術和自主創(chuàng)新基因檢測為核心，擁有高通量單細胞多組學測序、微生物單細胞測序、單細胞分選等平臺型產(chǎn)品線，集儀器、芯片、試劑、生信軟件的研發(fā)、生產(chǎn)、銷售于一體的整體解決方案供應商。公司創(chuàng)始人團隊來自哈佛大學，研發(fā)和運營團隊有著數(shù)十年跨國企業(yè)從業(yè)經(jīng)驗，由世界一流的科學家、行業(yè)資深前輩擔任顧問。墨卓生物致力于成為生命科學、精準醫(yī)療、農(nóng)林業(yè)育種等研究領域的上游科研儀器開發(fā)領跑者。